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Aug 16, 2023

Nature Methods volumen 20, páginas 1183–1186 (2023)Cite este artículo

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Detalles de métricas

Open-3DSIM es una plataforma de reconstrucción de código abierto para microscopía de iluminación estructurada tridimensional. Demostramos su rendimiento superior para la supresión de artefactos y la reconstrucción de alta fidelidad en relación con otros algoritmos en varias muestras y en un rango de niveles de señal a ruido. Open-3DSIM también ofrece la capacidad de extraer la orientación dipolo, allanando una nueva vía para interpretar estructuras subcelulares en seis dimensiones (xyzθλt). La plataforma está disponible como código MATLAB, un complemento de Fiji y una aplicación Exe para maximizar la facilidad de uso.

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) es la modalidad de superresolución implementada más universalmente en las ciencias biológicas porque ofrece imágenes longitudinales rápidas con baja fototoxicidad y es altamente compatible con el etiquetado fluorescente1,2,3. Con el florecimiento de SIM, se han desarrollado una variedad de algoritmos de reconstrucción de código abierto, como OpenSIM4, fairSIM5, SIMtoolbox6, HiFi-SIM7, etc. La disponibilidad de software de código abierto también impulsa las plataformas de hardware SIM personalizadas, como SLM-SIM8, DMD-SIM9, galvanómetro-SIM10, Hessian-SIM11, etc. La combinación de software y hardware ha creado una comunidad abierta y productiva para los investigadores de SIM.

En comparación con 2DSIM, 3DSIM duplica la resolución a lo largo del eje z1,12,13,14 así como en el plano xoy. Los algoritmos de reconstrucción 3DSIM se pueden encontrar en sistemas comerciales como GE OMX y Nikon N-SIM, o en software de código abierto como Cudasirecon1, AO-3DSIM14, SIMnoise15 y 4BSIM16. Sin embargo, las soluciones comerciales se limitan a plataformas de microscopía específicas. Todas las soluciones de código abierto son herramientas específicas para resolver ciertos problemas de imágenes y no son adecuadas para la reconstrucción 3DSIM genérica. También pueden generar artefactos graves u ofrecer poca facilidad de uso. Por el contrario, en el campo de 2DSIM o 3DSIM monocapa, OpenSIM4 explica sistemáticamente el principio de reconstrucción de SIM; fairSIM5 integra el algoritmo en Fiji para facilitar su uso por parte de investigadores biológicos; HiFi-SIM7 optimiza notablemente los resultados de la reconstrucción y tiene una interfaz gráfica de usuario fácil de usar. La falta de un software 3DSIM multicapa conveniente impide que los usuarios accedan a él y lo utilicen, y artefactos graves desafían la fidelidad y confiabilidad de 3DSIM. Por lo tanto, se necesita urgentemente una herramienta de reconstrucción 3DSIM bien establecida y fácil de usar en el campo 3DSIM para garantizar su mayor desarrollo.

Para abordar esta necesidad, aquí presentamos Open-3DSIM, que puede proporcionar una reconstrucción 3DSIM multicapa superior y robusta. Preparamos la versión de Fiji para que sea fácilmente accesible para los usuarios biológicos; proporcionar resultados intermedios para ayudar a los especialistas de hardware a verificar sus datos 3DSIM construidos en casa y abrir códigos fuente modulares para que los desarrolladores de software impulsen sus desarrollos futuros. A través de comparaciones con diferentes algoritmos en varias muestras y niveles de señal a ruido (SNR), demostramos que Open-3DSIM ofrece un rendimiento superior debido a la optimización de la estimación de parámetros y el filtrado espectral, lo que resulta en reconstrucciones de alta fidelidad con artefactos mínimos y información débil preservada. Además, Open-3DSIM puede extraer la información inherente de orientación dipolo, desbloqueando todo el potencial de 3DSIM en reconstrucción multicapa, multicolor, polarización y superresolución en lapso de tiempo.

El principio de Open-3DSIM se muestra en la figura complementaria 1 y en la nota complementaria 1. El patrón de iluminación estructurada tridimensional (3D)17 se genera mediante la interferencia de tres haces a través de la difracción de rejilla. Luego, los datos de la pila 3D se toman capa por capa, se convierten al dominio de la frecuencia y se separan mediante una matriz de separación de fases. Los componentes de ±primera frecuencia separados se desplazan para llenar el cono con fugas del componente de frecuencia cero, y los componentes de ±segunda frecuencia se desplazan para expandir el rango espectral del plano xoy. Por lo tanto, 3DSIM duplica el rango espectral en comparación con el campo amplio al llenar el 'cono faltante' en una función de conversión óptica (OTF) (Datos extendidos, figura 1 y notas complementarias 1 y 2) y obtener resultados de superresolución 3D.

Utilizamos el método de correlación cruzada5,7 para estimar la frecuencia, el ángulo, la fase y la profundidad de modulación de los patrones de iluminación estructurados para evitar la participación de parámetros iniciales que otros algoritmos 3DSIM requieren ingresar1,14,15,16. Para obtener un parámetro de frecuencia correcto, que es el primer paso de la estimación de parámetros, utilizamos los componentes de frecuencia +primero y +segundo. Aunque tradicionalmente estimar el pico de la segunda frecuencia es más preciso que la primera, el pico de la primera frecuencia tiene un contraste mayor que la primera frecuencia en SNR baja, como se muestra en la Fig. 1a. Por lo tanto, establecemos un criterio para determinar si la estimación a través del pico de la segunda frecuencia es confiable. De lo contrario, utilizaremos el primer espectro para estimar y garantizar la validez de la estimación de frecuencia. Entonces se pueden resolver con precisión los parámetros correspondientes, como la fase y el ángulo. Este método puede mejorar en gran medida la exactitud de la estimación de parámetros al reconstruir imágenes con una SNR baja, reduciendo así diversos artefactos causados ​​por errores de estimación de parámetros17,18.

a, Dominio de frecuencia separado e imagen con SNR baja, lo que demuestra que el primer pico de frecuencia es más alto que el segundo y es más fácil de reconocer. Las partes superior izquierda, superior derecha e inferior izquierda son los dominios de frecuencia cero, primero y segundo separados. La parte inferior derecha es la imagen sin editar de los filamentos de actina en U2OS con una SNR extremadamente baja, pero el primer patrón (visible debido a la frecuencia relativamente baja) es fácil de reconocer. Las barras de color en la esquina superior derecha de a tienen el formato 'Intensidad (au)'. b, Filtro de dos pasos diseñado por OTF, Notch, OTFnotch y Apo para optimizar el espectro de frecuencia de 3DSIM, logrando el efecto de reducir los artefactos y mejorar la resolución. Las líneas blancas a continuación representan sus perfiles correspondientes a lo largo de la frecuencia estimada. c, Resultados de la reconstrucción de filamentos de actina en U2OS, incluida la comparación del algoritmo de una sola capa (HiFi-SIM), el algoritmo multicapa (Open-3DSIM), la imagen de campo amplio (WF) y la imagen polarizada Open-3DSIM (pOpen) . Las barras de colores en 'pOpen' de c tienen el formato 'Ángulo (rad)'. Barra de escala, 2 μm. Escala en el eje z, 12 capas, 0,125 μm por capa. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares.

A continuación, de acuerdo con el vector de frecuencia estimado en los planos xoy y yoz, diseñamos un filtro de dos pasos en el dominio de la frecuencia basado en el filtro de muesca (Notch), la función de apodización (Apo), OTF y OTFnotch. Primero, diseñamos un filtro de muesca correspondiente a la frecuencia estimada y el tamaño de la imagen de entrada para mejorar la compatibilidad de diferentes imágenes. Demostramos que la cooperación del Filtro 1 y el Filtro 2 hará que el espectro 3D se acerque al espectro ideal, siendo suave y uniforme18,19, lo que puede suprimir el pico del espectro, reducir el ruido y compensar la borrosidad de alta frecuencia (Fig. 1b, Datos ampliados Fig. 1 y Nota complementaria 1 y 2). Este método para corregir un espectro anormal es importante para controlar los artefactos de las imágenes reconstruidas y mejorar aún más la resolución 3D, lo que hace que funcione bien con una SNR baja. Ilustramos cuidadosamente la función y la superioridad de los filtros de espectro (Datos ampliados, figura 2 y nota complementaria 3) y proporcionamos una guía para ajustar los parámetros (Datos ampliados, figura 3 y nota complementaria 4).

La Figura 1c muestra las imágenes 3DSIM de filamentos de actina en U2OS. Open-3DSIM puede mejorar la resolución xyz en comparación con las imágenes de campo amplio. Es más, Open-3DSIM que interpreta la estructura completa de actina puede eliminar en gran medida el desenfoque y los artefactos con una mejora del eje z en comparación con la reconstrucción de una sola capa como HiFi-SIM (Datos ampliados, figura 4, nota complementaria 5). También introducimos la dimensión de polarización en el plano xoy para realizar imágenes de orientación dipolo en Open-3DSIM20,21. La información de orientación dipolar del filamento de actina analizado se muestra en la Fig. 1c. El paralelismo entre la orientación del dipolo y la dirección del filamento de actina valida la exactitud de la información de polarización.

Para probar más a fondo el rendimiento de Open-3DSIM, primero realizamos la simulación utilizando una estructura en forma de pétalo y una estructura 3D de prueba de resolución, obteniendo resultados de alta fidelidad sin artefactos observables (Datos ampliados, figura 5 y nota complementaria 6). También comparamos Open-3DSIM con los algoritmos de reconstrucción 3DSIM tradicionales basados ​​en Wenier, como AO-3DSIM y 4BSIM, y descubrimos que Open-3DSIM los supera en comparación con sus resultados reconstruidos bien ajustados (Datos ampliados, figura 6 y nota complementaria 7). Debido a que SIMnoise optimiza el filtro basado en Wenier, comparamos los resultados de reconstrucción de Open-3DSIM, OMX y SIMnoise bajo gradiente SNR para filamentos de actina en U2OS en la Fig. 2a. Aquí, Open-3DSIM supera a OMX y SIMnoise en diferentes niveles de SNR con menos artefactos y fondos. Además, el error absoluto medio (MAE) y la SNR de Open-3DSIM son casi los mismos que los de otros algoritmos con condiciones de iluminación más altas en la Fig. 2b, lo que demuestra el excelente rendimiento de Open-3DSIM con una SNR baja. Aunque SIMnoise ha optimizado la reconstrucción con una SNR baja, Open-3DSIM muestra una mejor retención de información de borde y un efecto de eliminación de ruido en comparación con el resultado de última generación de SIMnoise en la Fig. 2c con menos tiempo de reconstrucción. De manera similar, en comparación con OMX, Open-3DSIM tiene una excelente capacidad para eliminar artefactos y retener información débil en la Fig. 2d. Se pueden ver más comparaciones de la reconstrucción en la hoja estándar cuantitativa fluorescente (Argolight) y varias muestras biológicas en las figuras de datos ampliados. 7 y 8 y las notas complementarias 8 y 9 para demostrar aún más el excelente rendimiento de Open-3DSIM.

a, Reconstrucción de filamentos de actina en diferentes condiciones de iluminación: extremadamente baja (EL, intensidad del 2%, tiempo de exposición de 5 ms), baja (L, 5%, 5 ms), moderada (M, 10%, 20 ms) y alto (H, 10%, 50 ms) con la comparación entre SIMnoise, OMX y Open-3DSIM. b, MAE bajo diferentes SNR y algoritmos, tomando los resultados de SNR más altos correspondientes como imágenes reales, con la SNR relativa de los resultados de la reconstrucción bajo diferentes SNR y algoritmos para demostrar la capacidad del algoritmo para suprimir un fondo desenfocado. c, Resultados de reconstrucción de última generación de la estructura de tubulina de SIMnoise bajo la SNR más baja con la comparación correspondiente. d, Reconstrucción de filamentos de actina de OMX bajo una SNR baja (5%, 20 ms) con la comparación correspondiente. e, La reconstrucción multicolor de Open-3DSIM del complejo de poro nuclear, filamento de actina y tubulina, excitados a 488, 561 y 683 nm de longitud de onda, respectivamente. f, Open-3DSIM analizó la estructura de la cresta mitocondrial en 3D y mostró el proceso de fusión, separación y apoptosis mitocondrial bajo una SNR baja (10%, 3 ms) durante 15 fotogramas (10 s y seis cortes por fotograma). g, Análisis de reconstrucción y polarización de filamentos de actina en secciones de riñón de ratón, incluida la vista 3D completa (en la parte superior) y la proyección de intensidad máxima en los planos xoy y xoz, con la comparación entre pOMX, pSIMnoise y pOpen. Las barras de color en g tienen el formato 'Ángulo (rad)'. La barra de escala es de 2 μm. Las escalas en el eje z son: a, 13 capas; c, 41 capas; d, diez capas; e, 13 capas; f, seis capas; y g, 41 capas. a, c, d, f, g 0,125 µm por capa; e, 0,12 µm por capa.

Además, demostramos que Open-3DSIM puede reconstruir con precisión muestras multicolores en la Fig. 2e con el sistema N-SIM y Datos extendidos Fig. 9, y la Nota complementaria 10 con el sistema OMX, que muestra una excelente capacidad de corte óptico y compatibilidad con diferentes estaciones de trabajo de microscopios. . Open-3DSIM también se aplica para analizar la estructura de las crestas mitocondriales en 3D en imágenes de lapso de tiempo. Observamos una estructura de cresta clara con el proceso de fusión, separación y apoptosis mitocondrial en condiciones SNR bajas, como se muestra en la Fig. 2f. Por último, utilizamos Open-3DSIM para reconstruir la estructura del filamento de actina en un riñón de ratón con imágenes de orientación dipolo que se muestran en la figura 2g; Se puede ver que la imagen polarizada Open-3DSIM (pOpen) supera a la imagen polarizada OMX (pOMX) y a la imagen polarizada SIMnoise (pSIMnoise) en gran medida en la supresión de artefactos y la eliminación de desenfoque, y se muestran más reconstrucciones de la orientación del dipolo fluorescente en Datos ampliados. Fig. 10 (Nota complementaria 11). Es de destacar que, con la calibración de intensidad, Open-3DSIM resolverá la orientación del dipolo con mayor precisión que con las suposiciones predeterminadas. Para ayudar a los usuarios a utilizar Open-3DSIM, también proporcionamos los parámetros de reconstrucción en la Tabla complementaria 1 y los datos típicos de 3DSIM en la Tabla complementaria 2 con resultados, parámetros y comparaciones.

Con un rendimiento excelente en alta fidelidad, bajo nivel de artefactos, eliminación de desenfoque y retención débil de información, Open-3DSIM realmente puede liberar el potencial de 3DSIM en superresolución lateral y axial, a través de imágenes multicolores, multicapa, de lapso de tiempo y con orientación dipolo. . Open-3DSIM es multiplataforma, no está limitado por estaciones de trabajo de microscopios específicas y puede personalizarse y ajustarse según las necesidades del usuario. También es extensible, ya que es totalmente compatible con otros métodos de optimización de algoritmos basados ​​en términos regulares o aprendizaje automático. Esperamos que Open-3DSIM sea el estándar de código abierto para la reconstrucción multidimensional de 3DSIM y creemos que los esfuerzos de código abierto marcarán una gran diferencia para la comunidad.

Las líneas celulares U2OS de osteosarcoma humano (HTB-96, ATCC) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, GIBCO) que contenía suero bovino fetal (GIBCO) inactivado por calor al 10 % y 100 U ml-1 de penicilina y 100 µg ml-1 de estreptomicina. solución (PS, GIBCO) a 37 °C en una incubadora con 95% de humedad y 5% de CO2. Las células fijas se sembraron en el no. Cubreobjetos de 1,5 H (CG15XH, Thorlabs) antes de que crecieran hasta una densidad adecuada (24 h) y se fijaran con formaldehído al 4% (R37814, Invitrogen) durante 15 min. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar el formaldehído. Se utilizó Alexa Fluor 488 Phalloidin (A12379, Invitrogen) para teñir los filamentos de actina durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, se selló el cubreobjetos en el portaobjetos con el medio de montaje antifade prolongado (P36941, Invitrogen).

Las células COS7 se cultivaron en DMEM (GIBCO) que contenía suero bovino fetal (GIBCO) al 10% (V/V) y 100 U ml-1 de penicilina y 100 µg ml-1 de solución de estreptomicina (PS, GIBCO) a 37 °C en un Incubadora con atmósfera de 95% de humedad y 5% de CO2. Las líneas celulares seleccionadas se sembraron en el no. Cubreobjetos de 1,5 H (CG15XH, Thorlabs) antes de que crecieran hasta una densidad adecuada (24 h) mediante incubación en una atmósfera húmeda que contenía 5% (V) de CO2 a 37 °C. Las células se tiñeron en DMEM que contenía MitoTracker Orange 500 nM (M7510, ThermoFisher) y dimetilsulfóxido al 0,5% durante 20 minutos en una incubadora de CO2. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 4% (R37814, Invitrogen) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El cubreobjetos se selló sobre la cavidad del portaobjetos. El cubreobjetos se selló sobre el portaobjetos con el medio de montaje antifade prolongado (P36941, Invitrogen). Para obtener imágenes de células COS7 vivas, las células COS7 se sembraron en µ-Slide 8 Wellhigh (80806, ibidi). Las células COS7 se tiñeron en DMEM que contenía IMMBright660 500 nM y dimetilsulfóxido al 0,5% durante 20 minutos en una incubadora de CO2. Luego, las células se mantuvieron en DMEM para obtener imágenes de células vivas sin lavar.

Las secciones de riñón de ratón utilizadas para reconstruir los filamentos de actina se adquirieron en ThermoFisher. Alexa Fluor 568 marcó los filamentos de actina utilizando Prolong Diamond para incrustarlos.

Las células COS7 utilizadas para reconstruir el complejo de poros nucleares se adquirieron de GATTA Quant. Anti-Nup fue etiquetado por Alexa Fluor 555 usando Prolong Diamond para incrustar.

Las células endoteliales de las arterias grandes bovinas utilizadas para reconstruir la muestra multicolor se compraron de ThermoFisher. Las mitocondrias se marcaron con MitoTracker Red CMXRos fluorescente rojo, la actina F se tiñó con faloidina Alexa Fluor 488 fluorescente verde y se usó 4,6-diamidino-2-fenilindol fluorescente azul para marcar los núcleos usando Prolong Diamond para incrustar.

Obtenemos datos basados ​​en el sistema comercial OMX-SIM (DeltaVision OMX SR, GE) usando un objetivo de inmersión en aceite (Olympus, ×60 1.4 apertura numérica (NA)) y un sistema comercial N-SIM (Nikon) usando un objetivo de inmersión en aceite (CFI Apocromático, ×100 1,49 NA).

Para el sistema OMX, se realizaron secuencias 3DSIM con un tamaño de píxel de 80 y 125 nm en el plano xoy y xoz (cinco fases, tres ángulos y 15 imágenes sin procesar por plano). Y para el sistema N-SIM se realizaron secuencias 3DSIM con un tamaño de píxel de 65 y 120 nm en el plano xoy y xoz (cinco fases, tres ángulos y 15 imágenes en bruto por plano).

Las muestras de la Fig. 2c y de los datos ampliados de la Fig. 8a se obtuvieron de datos de código abierto en SIMnoise (v.1.0)15,22 (https://data.4tu.nl/articles/_/12942932). Las células COS7 en la Fig. 2e se obtuvieron de C. Leterrier (Universidad Aix Marseille) utilizando el sistema Nikon. Ejemplos en datos ampliados Figs. 2a, 3a y 4b se obtuvieron de datos de código abierto en fairSIM (v.1.5.0)5 (http://www.fairsim.org/). La estructura simulada en Datos extendidos Fig. 5a se obtuvo a partir de datos de estructura 3D de código abierto (v.1.2)23 (https://github.com/Biomedical-Imaging-Group/GlobalBioIm). La imagen de prueba de resolución simulada en Datos extendidos Fig. 5b es ISO12233:2000 (Imatest). Los datos ampliados, la Fig. 6a, se obtuvieron de AO-3DSIM (v.1.0.0)14 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSST629). Los datos ampliados Fig. 6b se obtuvieron de 4BSIM (v.1.0)16 (https://zenodo.org/record/6727773).

Open-3DSIM admite tres formatos de datos, incluidos OMX (*.dv/*.tif/*.tiff), N-SIM (*.nd2/*.tif/*.tiff) y algunos sistemas caseros (*.tif/ *.pelea). La secuencia de imágenes para OMX es fase, profundidad, canal, tiempo y luego ángulo. La secuencia de imágenes para N-SIM es imagen (ángulo en filas y fase en columnas), profundidad, canal y luego tiempo. La secuencia de imágenes para los sistemas caseros es fase, ángulo, profundidad, canal y luego tiempo. Sugerimos utilizar muestras de seis o más capas para la reconstrucción para obtener resultados óptimos.

ImageJ generó el dominio de frecuencia y la SNR de las imágenes. Para comparar se utilizan HiFi-SIM (v.1.01)7, SIMnoise (v.1.0)15, OMX, AO-SIM (v.1.0.0)14 y 4BSIM (v.1.0)16. Las reconstrucciones de Open-3DSIM se procesaron con MATLAB (v.2018a, 2021a y 2021b) e ImageJ. Las figuras se trazaron con Imaris (v.9.0.1), Visio (v.2016), Origin (v.2021b) y Adobe Illustrator (v.2020).

Se prepararon perlas fluorescentes (ThermoFisher Scientific) de 200 nm de diámetro en un portaobjetos fijo20. OMX tomó imágenes de las perlas en tres ángulos con cinco fases en cada ángulo. Al promediar imágenes de las cinco fases, se pueden obtener imágenes de campo amplio de cada ángulo. Para corregir la intensidad de la luz en cada punto, las perlas deben ser gruesas en el plano focal. Luego se utiliza la interpolación para compensar el espacio de las cuentas para formar un mapa de intensidad de luz de calibang1, calibang2 y calibang3. La relación de calibración de calib1 y calib2 se puede expresar como:

MAE y SNR en la Fig. 2b se utilizan para evaluar la reconstrucción de Open-3DSIM, SIMnoise y OMX-SIM. Después de la calibración de la imagen para compensar la vibración durante el disparo, los resultados correspondientes de SNR alta bajo diferentes algoritmos se utilizan como verdad sobre el terreno y(i), por lo que las imágenes de SNR baja y′(i) se calculan usando MAE:

donde i denota el iésimo píxel de m píxeles completos, y SNR se utiliza para evaluar la capacidad de eliminar el fondo desenfocado de diferentes algoritmos. Elegimos la parte con señal y la parte sin señal para resolver su valor medio y varianza, y usamos la siguiente fórmula para resolver SNR (dB):

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos complementarios, los parámetros, las comparaciones correspondientes y el vídeo de instalación de la versión ImageJ se han subido a Figshare (https://figshare.com/articles/dataset/Open_3DSIM_DATA/21731315)22,24.

El software, los datos de prueba y las guías de usuario detalladas para Open-3DSIM (MATLAB, ImageJ y Exe) se han subido a GitHub (https://github.com/Cao-ruijie/Open3DSIM). Reclamamos una licencia de Apache para Open-3DSIM.

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Descargar referencias

PX agradece el apoyo financiero del Programa Nacional Clave de I+D de China (subvención n.º 2022YFC3401100) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.º 62025501, 31971376 y 92150301). Agradecemos al Centro Nacional de Ciencias de las Proteínas de la Universidad de Pekín en Beijing, China, por su ayuda con las imágenes de súper resolución GE DeltaVision OMX. Agradecemos a C. Leterrier (Universidad Aix Marseille) por proporcionar datos del sistema Nikon N-SIM.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Facultad de Tecnología del Futuro, Universidad de Pekín, Beijing, China

Ruijie Cao, Yaning Li, Xin Chen, Meiqi Li, Meiling Guan, Yiwei Hou, Yunzhe Fu, Xinzhu Xu y Peng Xi

Centro Nacional de Imágenes Biomédicas, Universidad de Pekín, Beijing, China

Ruijie Cao, Yaning Li, Xin Chen, Meiqi Li, Meiling Guan, Yiwei Hou, Yunzhe Fu, Xinzhu Xu y Peng Xi

Laboratorio Clave de Ciencia y Tecnología Analíticas de la Provincia de Hebei, Facultad de Química y Ciencias Ambientales, Universidad de Hebei, Baoding, China

Xichuan Ge y Baoxiang Gao

Instituto de Ingeniería Biomédica, Instituto de Innovación Colaborativa de Beijing, Beijing, China

Shan Jiang

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RC y PX concibieron la idea de Open-3DSIM. PX supervisó la investigación. RC, PX, YL, XC y MG dedujeron la teoría de Open-3DSIM. RC y ML diseñaron y realizaron la mayoría de los experimentos. ML, XG, BG, SJ e YF prepararon la muestra. RC, PX, YL, XC, YH, ML, MG y XX discutieron la teoría de Open-3DSIM. RC y XC discutieron la optimización de la estimación de parámetros. RC e YL realizaron la optimización del espectro de datos. RC escribió el código de Open-3DSIM. RC, YL, ML, YH y PX escribieron el artículo con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Peng Xi.

PX y RC son inventores en una solicitud de patente presentada relacionada con este trabajo (ZL202211605447.2). Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Methods agradece a Hui Li, Marcel Muller y Lin Shao por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles. Editora principal: Rita Strack, en colaboración con el equipo de Nature Methods.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

En las barras de colores, en el formato 'Intensidad [au]'.

a, Efecto de la optimización del espectro, incluida la reconstrucción después del filtro de muesca, después del Filtro1 y después del Filtro2, tomando como ejemplo el filamento de actina en las células endoteliales sinusoidales del hígado (LSEC) de fairSIM. Las flechas blancas muestran que después de dos filtros, los artefactos se vuelven menos y el perfil blanco muestra que se mantiene la información de alta frecuencia. b, Los resultados y espectros de la reconstrucción (incrustados arriba a la derecha) entre diferentes algoritmos, tomando el filamento de actina en la Fig. 2a como ejemplo. Barra de escala: 2 μm (tres líneas superiores y dos líneas inferiores), 1 μm (dos líneas del medio). Escala en el eje z: a, 7 capas, b, 13 capas, 0,125 μm por capa.

a, El diagrama de Filtro1 y Filtro2. b, El efecto de diferentes parámetros (w1 y w2) en el perfil de Filtro1 y Filtro2 (línea blanca en a). c, El resultado reconstruido del filamento de actina con w1 = 0,5, w2 = 0,1. d, El efecto de diferentes w2. e, El perfil en d con diferente w2. f, El efecto de w1. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: 7 capas, 0,125 μm por capa.

a, Complejo de poros nucleares fotografiado por OMX. b, Filamento de actina en células de osteosarcoma U2OS de fairSIM. Calibración de resolución cuantitativa de WF, HiFi-SIM y Open-3DSIM, incluidos los resultados de c, Argolight yd, cuentas fluorescentes dispersas. Y el perfil ajustado en el eje z de e, Argolight y f, escasas cuentas fluorescentes para cuantificar el tamaño completo de media altura y la resolución en función de 10 puntos seleccionados al azar. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: a, 17 capas, b, 8 capas, c, 33 capas, d, 8 capas, 0,125 μm por capa.

a, La comparación de imágenes de verdad de fondo (GT), WF y Open-3DSIM y la comparación entre diferentes sectores z de slice21 y slice11 utilizando una estructura 3D de código abierto. b, La comparación de GT, WF y Open-3DSIM utilizando una imagen de prueba de resolución. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: a, 33 capas (0,125 μm por capa), b, 41 capas (0,125 μm por capa).

a, La actina de la célula epitelial del cristalino α-TN4, cuya reconstrucción se deriva de AO-3DSIM. b, La membrana de B. subtilis esporulada, cuya reconstrucción se deriva de 4BSIM. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: a, 26 capas, 0,2 μm por capa, b, 32 capas, 0,125 μm por capa.

incluyendo a, estructura cruzada yb, estructura lineal (el intervalo de cada línea es de 0, 30, 60 a 390 nm). Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: a, 26 capas, b, 33 capas, 0,125 μm por capa.

a, Cuentas con la reconstrucción más moderna de SIMnoise1 con SNR baja. b, Estructura mitocondrial con SNR baja. c, Complejo de poros nucleares con alta SNR. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: a, 33 capas, b, 9 capas, c, 25 capas, 0,125 μm por capa.

Reconstrucción en una muestra multicolor del núcleo, el filamento de actina y la mitocondria, excitados a 405, 488 y 568 nm de longitud de onda, respectivamente. Y la comparación de WF y Open-3DSIM en diferentes cortes z de los cortes 6, 8 y 10. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: 17 capas, 0,125 μm por capa.

a, Comparación entre imagen de campo amplio, Open-3DSIM y pOpen. b, Calibración de intensidad de diferentes ángulos de iluminación. La relación de intensidad entre el ángulo2 y el ángulo1 se describe como 'Calib1', y la relación de intensidad entre el ángulo3 y el ángulo1 se describe como 'Calib2'. c, Reconstrucción de más estructura de actina. Barra de escala: 2 μm. Escala en el eje z: 9 capas, 0,125 μm por capa. En las barras de colores, en el formato 'Ángulo [rad]'.

Figura complementaria 1, notas 1 a 11 y tablas 1 y 2.

Esto incluye tres plataformas de Open-3DSIM.

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Reimpresiones y permisos

Cao, R., Li, Y., Chen, X. et al. Open-3DSIM: una plataforma de reconstrucción de microscopía de iluminación estructurada tridimensional de código abierto. Métodos Nat 20, 1183-1186 (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01958-0

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Recibido: 01 de diciembre de 2022

Aceptado: 12 de junio de 2023

Publicado: 20 de julio de 2023

Fecha de emisión: agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-023-01958-0

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